• ＩＰＴＧ誘導


    • 　ＬＢ培地200mlに100mg/mlのアンピシリン200μlを加える。
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    　前日に増やしておいた目的の大腸菌液を4ml加えて37℃で約2時間インキュベート。
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    　溶液の600nmでの吸光度が0.5〜0.6になったところで0.5〜1.0MのＩＰＴＧを200μl加える。
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    　さらに37℃で2〜2.5時間インキュベート。
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    　大腸菌の入ったフラスコを氷につけ50mlのチューブに分注する。
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    　2500〜3000rpmで15分遠心し、上澄みを除く。
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    　PBSで2〜3回washし、ペレットを得る。

    　
  • ウエスタンブロット
    • western

    　タンパクをポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。
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    　ゲルをメンブレンに転写（transfer)する。
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    　メンブレンを5%スキムミルク溶液中で1時間インキュベート（ブロッキング）。
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    　１次抗体を500〜10000倍程度に希釈しメンブレンを入れて30分〜1時間インキュベート。
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    　TBS+0.1%Tween溶液で1時間程度washする。
    　　　　　　　　　　　　↓
    　２次抗体を2000倍に希釈しメンブレンを入れて30分〜１時間インキュべート。
    　　　　　　　　　　　　↓
    　TBS+0.1%Tween溶液で1時間程度washする。
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    　メンブランを専用の発色液に１分つけ、Ｘ線フィルムに５〜３０分感光させる。
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    　Ｘ線フィルムを現像液→停止液→定着液の順につけていき、現像を行う。


  • LB培地、LBプレート


    • 　水100 mlに対して、
    　Bacto-tryptone 　　　 　1.0 g
    　Bacto-yeast extract　 　0.5 g
    　NaCl 　　　　　　 　 　　　1.0 g
    　agar　　　　　　　　　　　　1.5 g (LBプレート作成の場合）

    　を加え、オートクレーブにかける。
    　その後、LBプレートの場合、100mg/mlのアンピシリンを100μl加え、
    　滅菌シャーレに分注して冷却する。

  • トランスフォーメーション


    • 　凍ったコンピテントセルを室温でゆっくりと溶かし、100μl分注して10分氷中に置く。
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    　プラスミドDNAを適量加え、軽くタッピングしてから氷中に30分置く。
    　　　　　　　　　　　　↓
    　42℃の恒温槽に30秒間入れ、ヒートショックをあたえる。
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    　氷中に2、3分つけ、SOBを800μl加える。
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    　37℃で1時間振り、その後LBプレートにぬりこむ。


  • 細胞の継代


    • 　dish内のメディウムを完全に吸い取る。
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    　EDTAを含んだ0.05%トリプシン溶液を１〜２ml加え30秒〜1分なじませる。
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    　トリプシン溶液を吸い取る（溶液を完全には吸わず、少し残す）。
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    　ＣＯ２インキュベータの中に３〜５分置く。
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    　顕微鏡で細胞が丸くなっていることを確認する（細胞がはげている状態）。
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    　dishを傾けながらメディウムで細胞を流し落として回収する。
    　　　　　　　　　　　　↓
    　新しいメディウムを入れたdishに回収した細胞溶液を適量いれ、ＣＯ２インキュベータの中に戻す。


  • ポリアクリルアミドゲル


    • 　Separation Gel(サンプル分離用）とStack Gel（サンプルバンド濃縮用）のそれぞれについて、
    　Ammonium persulfateとTEMED以外の溶液を下表の割合で混ぜる。
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    　ゲル板を用意し、Separation Gel溶液にAmmonium persulfateとTEMEDを加え、
    　しばらく混ぜたあと、ゲル板の下端から６cmくらいまで溶液を加える。
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    　ゲルの上に泳動用バッファーを入れ、光の下で20分程度放置する。
    　　　　　　　　　　　　↓
    　ゲルが固まったら上の泳動用バッファーを捨て、Ammonium persulfateとTEMEDを加えた
    　Stack Gel溶液を加え、コームをさして30分〜1時間置いて固める。

    Separation Gel(10%)Stack Gel
    Acrylamido/Bis(30%/0.8%)４．１５ml０．８３５ml
    １M Tris-HCl４．６５ml(pH8.8)０．６２５ml(pH6.8)
    10% SDS０．１２５ml０．０５ml
    H２O３．５２ml３．４９ml
    10%Ammonium persulfate０．０５ml０．０２ml
    TEMED０．０１ml０．００５ml


  • ミニプレップ


    • 　溶液を1.5mlのチューブに移し15,000rpmで3分遠心。(大腸菌が沈殿）
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    　LB培地を完全に吸い出し、ペレットを100μlのTEに溶かす。
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    　0.2N NaOH/1% SDS溶液を200μl加え、静かに混ぜた後、氷中に5分放置。(アルカリ変性）
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    　3M NaOAcを250μl加え静かに混ぜた後、氷中に10分放置。（タンパクが析出）
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    　15,000rpmで10分遠心し、上清を別のチューブに移す。
    　　　　　　　　　　　　↓
    　上清にPCI（フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール）を550μl加え、20秒ボルテックスした後、
    　15,000rpmで5分遠心。(フェノール抽出）
    　　　　　　　　　　　　↓
    　上の水溶液層のみを別のチューブに移し、-20℃のエタノールを1ml加える。（エタノール沈殿）
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    　15,000rpmで10分遠心した後、デカンテーションで溶液を捨て、70%エタノールを1ml加える。
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    　15,000rpmで5分遠心し、デカンテーションで溶液を捨て、5分程度減圧乾燥する。
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    　10ng/μlのRNase/TE溶液50μlに溶解させ、37℃で30分インキュベート。
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    　20%ポリエチレングリコール/2.5M NaCl溶液を30μl加え、氷中に1時間放置。（PEG沈殿）
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    　15,000rpmで10分遠心し、上清を吸引し、70%エタノールを加えて15,000rpmで5分遠心。
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    　最後に50μlのTE溶液に溶解させる。



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